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2020年2月7日，由四川大学华西医院牵头，北京大学第三医院、华中科技大学同济医学院附属同济医院、空军军医大学西京医院、浙江大学附属第一医院等参与的多中心临床研究发表在Nature旗下期刊Scientific Reports上。该研究利用鹍远基因的OncoAim®肿瘤突变panel对来自这些医院的近500份非小细胞肺癌（NSCLC）患者FFPE样本进行了检测，相关性能表现非常出色。

Scientific Reports官网截图

这项研究应用鹍远基因自主研发的OncoAim®肿瘤突变panel（以下简称“OncoAim®”），基于高通量测序技术（NGS），对452例NSCLC患者的福尔马林固定石蜡包埋（FFPE）样本进行了基因检测，并验证了OncoAim®的检测性能。结果显示，对于覆盖深度> 500×、等位基因频率（mutations with allele frequency，MAF）≥5％的NSCLC基因突变，OncoAim®肿瘤突变panel的总体检测性能十分强大，具体表现为灵敏度> 99％，特异性>99％，以及94％的准确性和96％的可重复性。除此之外，该研究还描述了中国NSCLC患者基因组突变的新特征。

 一、研究样本有哪些特征？ 

该研究所检测的FFPE样本来自于从2013年至2016年4家合作医院的病理档案，452例NSCLC患者FFPE样本的纳入标准具体为：（1）患者明确诊断为“非小细胞肺癌”；（2）5年内取样；（3）肿瘤细胞含量≥20％。病理学家检查了4μm的苏木精-伊红染色切片，以确保样本体积≥1mm3，有核细胞率≥80％或≥30000个细胞以及肿瘤细胞含量≥20％。同时，收集临床病理信息用于关联分析。

 二、研究是怎样进行的？ 

研究人员对FFPE样本提取DNA后，进行了文库制备和高通量测序，然后使用OncoAim panel管线对测序数据进行了分析，每个基因座的中位覆盖范围为500–1000x， SNV和INDEL的最小突变MAF设置为5％，以确保可靠地检出突变。最后根据6种商业文库参考标准（HD200、HD300、HD301、HD706、HD802和HD260），该研究评估了OncoAim®对FFPE标本中的点突变（single nucleotide variants ，SNV）以及基因插入/缺失（short insertions and deletions ，INDEL）的检测性能。

图1 NSCLC-FFPE样品NGS分析工作流程

在性能验证方面，研究团队对敏感度与特异性分析是这样进行的：

检测到参考标准中的突变，视为真阳性（TP， true positive），未检测到参考标准中的突变，视为假阴性（FN，false negative）。用检测到的次数/采样次数，计算每个测试点的灵敏度。

进行特异性分析时，检测到的突变是参考标准或亲本细胞系中的已知突变，视为TP；如果检测到的突变不是已知突变，则视为假阳性（FP，false positive）。阳性预测值（Positive predictive value，PPV）计算为TP/（TP+FP）。

 三、研究有哪些惊喜结果？ 

1.OncoAim®在SNV检测方面具有高灵敏度和高特异性

对于OncoAim®在SNV方面的检测性能（敏感性和特异性），研究团队使用了4种单独的参考标准（即HD200，HD300，HD301和HD802）和4种混合参考标准（即HD300-HD706，HD802-HD260，HD301-HD706和HD200-HD706）。这些参考文库共拥有54种已知的SNV，MAF范围为1％～70.0％，中位测序覆盖深度为1025×～1469×。

 结果发现，OncoAim®对整体SNV的检测性能很高：当MAF≥5％时，成功检测出了99％（40/40）的预期SNV，并且在MAF <5％的情况下也发现了79％（11/14）的SNV变化。此外，当PPV> 99％（51/51）时，可保持高特异性。

 随后，通过随机二次采样数据，研究团队评估了测序覆盖深度（50～1000x）和MAF对SNV检测的影响。随着所有MAF区段的覆盖深度增加（<5％，5-10％和≥10％），检测灵敏度稳步提高，中位覆盖深度为500x时，可达最高灵敏度（图 2A） 。当MAF≥5％，中位覆盖深度为500x时，OncoAim®成功检测到预期SNV中的> 99％（400/400）。此外，在整个覆盖深度范围内，PPV仍然很高（> 99％）。该研究还发现，在检测SNV时，预期和观察到的MAF之间有很高的相关性（图2C），突出了OncoAim®检测稳定的定量特征。

图2  OncoAim®对SNV和INDEL检测性能
（SNV面板A，C；INDEL面板B，D）

2.OncoAim®在INDEL检测方面具有高灵敏度和高特异性

为了对OncoAim®进行INDEL检测验证，研究团队使用了3个单独的参考标准（即HD200，HD300和HD802）和3个混合参考标准（即HD200-HD706，HD300-HD706和HD802-HD260）。这些参考文库包含7个已知的INDEL，其MAF和INDEL的长度范围很广（3～15bp）。6个样品的平均测序覆盖深度为1232x。

研究团队观察到了OncoAim®较高的整体检测性能：当MAF≥5％时，成功检测到了＞99％（5/5）的预期INDEL，PPV也＞99％（5/5）。

通过二次采样数据，研究团队评估了测序覆盖深度和MAF对INDEL检测性能的影响。在MAF≥5％时，INDEL检测灵敏度随覆盖深度的增加而增加，并且在中位覆盖深度达到700x时可观察到高灵敏度，即成功检测到> 99％的INDEL（15/15）。在低MAF（<5％）时，随着覆盖深度的变化，检测灵敏度的波动趋势（图 2B）。此外，在整个覆盖范围内，PPV可达到85～100％。同样地，INDEL的检测与预期MAF之间的相关性也很高（图 2D），再次说明OncoAim®有稳定的定量特征。

3.OncoAim-NGS检测与ARMS-PCR检测一致性高达94%

众所周知，ARMS-PCR（扩增阻滞突变系统PCR）有操作简单、快速、灵敏度高（可检测低至1%的突变）等优点，但检测通量低、不能检测未知突变也是ARMS-PCR技术的固有缺点。

研究团队使用OncoAim-NGS检测和ARMS-PCR技术测试了253个NSCLC FFPE样本的EGFR突变状态，两种技术共检测到126个EGFR突变，其中这两种技术都检测到的突变有119个，一致性达94％（图  3）。通过ARMS-PCR检测到6个突变，未被NGS发现。研究团队认为，这可能是由于这些突变的MAF过低和/或肿瘤异质性所致。NGS也检测到了一种未被ARMS-PCR发现的TP53突变，这一突变在Sanger测序中被确认。

图3 OncoAim和ARMS-PCR检测NSCLC FFPE样本的一致性

4.OncoAim-NGS在FFPE样本中具有可重复性，结果高度一致

研究团队用具有5种已知改变的3个FFPE肿瘤样本评估了OncoAim®肿瘤靶向试验的精密度，即其再现性和重复性。在这5种已知的突变中，KRAS和EGFR的突变是由ARMS-PCR方法检测的，TP53突变用NGS（Illumina-Miseq平台）检测。

在3个不同的实验中，研究团队对样本进行了5次分析，以评估运行间和运行内的再现性。最终结果显示，重复检测分析之间的一致性为96%，而且运行间和运行内的重复没有显著差异，这些结果充分证明了OncoAim®NGS测序的稳定性。

5.绘制了中国非小细胞肺癌患者的基因突变谱

在452份FFPE样本中，有30份因DNA质量差、文库浓度低、中位阅读覆盖率和一致性低等原因未能成功测序，最终有422份样本成功测序，用于后续变异分析。随后，研究团队利用OncoAim®分析了422例中国非小细胞肺癌患者的突变情况。

最终，研究团队发现，在422个FFPE样本中，约有70％（295个）具有至少1个突变，总共检出了21个基因中的479个突变。用单个基因突变数除以患者数计算的基因突变频率为0.24%～50%。前5个突变最频繁的基因是EGFR（211，50％），TP53（149，35％），KRAS（24，5％），PIK3CA（21，5％），以及PTEN（16，4 ％）（图  4）。此外，研究还发现，一些患者有不止1个EGFR突变，从176个样本中检测到211个EGFR突变；还有一名患者被发现有2个PTEN突变。

图4 该研究NSCLC患者的突变的基因、像差数和突变频率

如图5所示，错义突变（Missense mutation）是几乎所有前10位突变基因中最普遍的形式，但PTEN基因例外，其突变类型以框内插入（ in-frame-insertion）为主。在EGFR和TP53突变中，框内缺失（In-frame-deletion ）和无义突变（nonsense mutation）排在第二位。KRAS、PIK3CA、NFE2L2和CTNNB1的所有突变均为错义型。

图5 Oncoplot描述NSCLC患者最常见的前10个突变基因

6.NSCLC患者的临床特征与基因突变有密切的关联

这项研究评估了NSCLC患者基因突变与性别、年龄、吸烟等临床特征之间的关联，但在不同的肿瘤部位（左肺与右肺）未发现基因突变的差异。

 01）突变与性别
该研究观察到，女性患者的EGFR突变频率明显较高，而TP53和PTEN的突变频率则明显较低（图6），与先前的其他研究报道一致。有趣的是，PTEN突变在男性患者中更为普遍。

图6 不同性别患者的基因突变频率

02）突变与年龄

与中年组（45～65岁）相比，年轻组（18～45岁）的EGFR突变率显著降低，结果与其他研究一致。与中老年组（> 65岁）相比，青年组中TP53突变的频率较低。

图7 不同年龄组患者的基因突变频率

 03）突变与吸烟

吸烟是肺癌的重要危险因素。这项研究中，吸烟者KRAS突变频率增加，与其他报告一致。但是，PIK3CA像差与吸烟状态呈正相关，这与之前对日本肺癌患者的研究不一致，该研究认为这种不同的结果可能是种族差异造成的。

 04）突变与转移

淋巴结转移是不良预后的有力独立预测因子。这项研究发现，发生淋巴扩散的肺癌富含EGFR和TP53突变，表明具有EGFR或TP53突变的肺部肿瘤更有可能发生转移性肿瘤，预后可能较差。先前的研究报告已经证实了EGFR表达水平在患有淋巴结转移的肺癌患者中更高，这项研究进一步巩固了这些发现。

我们都知道，肺癌在晚期倾向于扩散到其他身体部位，形成转移性肺肿瘤。该研究的发现是，与原发性肺肿瘤相比，转移性肺肿瘤的EGFR突变频率更高。这提醒我们，对于具有EGFR驱动基因突变的原发性肺肿瘤患者，应仔细筛查和监测潜在的转移情况。

 05）突变与肿瘤组织学等级

肺癌的组织学等级是患者存活率的独立预测因子。这项研究观察到，分化良好的肿瘤与中分化肿瘤相比，EGFR和TP53的突变频率明显更低。与低分化肿瘤相比，高分化肿瘤还具有较低的EGFR和TP53突变频率，但这些差异未达到显著水平。研究团队认为，高分化肿瘤中EGFR和TP53的低突变频率可能代表了更好的预后指标。

 06）突变与肿瘤组织学亚型

腺癌（ACA）和鳞状细胞癌（SCC）是NSCLC的两种主要组织学亚型，它们具有独特的基因表达谱，且有不同的临床意义。

这项研究发现，EGFR突变在ACA中更为普遍，但TP53，PIK3CA和NFE2L2的突变在SCC中富集。这些结果表明，在ACA中，RTK（受体酪氨酸激酶）信号通路激活丰富，而PI（3）K通路激活、氧化应激通路激活和TP53通路抑制在SCC中更为普遍。尽管之前已经报道过每种基因之间的相关性，但这项研究首次揭示了这4种基因在肺癌队列研究中的组织学亚型关联。转录因子NFE2L2在调节参与抗氧化和应激反应的基因表达中起着关键作用，检测到D29Y、D29H和R34Q变体（第2外显子）可能提示肺癌预后不良。

7.NSCLC患者的基因突变间有互斥和共存现象

这项研究的数据表明，EGFR与KRAS，TP53，NFE2L2和BRAF为互斥突变（图  8）。EGFR与KRAS或BRAF突变之间有相互排他性，是已知的。这项研究为NFE2L2突变与EGFR突变不共存提供了第一个证据，巩固了NFE2L2突变的致癌性。另一有趣的发现是，TP53突变与EGFR突变相互排斥，达到了显著水平。这一新的观察结果在一定程度上支持了RAS和TP53在急性髓性白血病中表现出相互排斥性的发现，这表明单独灭活TP53可能足以使肺癌细胞增殖并避免凋亡。

图8 NSCLC患者基因突变中的互斥与共存

注：
A．Oncostip图显示了样本中所有突变的分布，样本中EGFR，TP53，KRAS，PTEN，NFE2L2和BRAF中至少有一个畸变。
B. 描述了互斥的基因对或同时存在的基因对。

研究团队还观察到， PTEN突变倾向于与BRAF突变一致（图8）。PTEN突变可导致PI（3）K通路的激活，虽然在肺癌中尚未见到PTEN和BRAF突变共存的研究报道，但PIK3CA突变与BRAF突变有关。此外，在黑色素瘤中，功能丧失PTEN突变和BRAF激活突变可以共存。这些结果表明，在某些类型的肺癌中，通过PTEN突变导致抑制丢失而激活PI（3）K信号通路，可以与BRAF依赖的RTK信号通路激活协同促进肿瘤的发展。

 四、小结 

图片 | 站酷海洛

随着精准医疗的发展与NGS技术革新，基因检测已经成为用于肺癌诊断的不可缺少的工具。在这项多中心合作的研究中，研究团队首先基于FFPE样本对OncoAim®进行了广泛的性能评估，然后探讨了中国NSCLC患者的基因突变特征。

整个NGS过程的运转时间约为2-3天。该研究证明了，OncoAim®对SNV和INDEL都具有很高的灵敏度、特异性、准确性和精密度，假阴性结果主要出现在低频变异（MAF <5％）。检测灵敏度随着测序覆盖深度的增加而提高，在一定覆盖深度（SNV为500x，INDEL为700x）下，MAF≥5％变异体的检测灵敏度高达100％，而且在整个测序覆盖范围（50-1000×）上均获得了高特异性。对于MAF≥5％的突变，OncoAim®检测与ARMS-PCR检测显示出高度的一致性（94％），表明OncoAim®检测的精度很高。两者合计，可以得出结论，基于NGS的OncoAim®检测在FFPE样本中具有强大的性能。

OncoAim®涵盖了中国最常见的6种癌症类型（食道，胃，肝，肺，乳腺和结肠）的常见突变，包括59个癌症基因中的6000个热点。因此，除肺癌外，OncoAim®检测还可应用于其他癌症。其中，OncoAim®在结直肠癌方面的多中心研究相关数据已经在2018年发表于欧洲病理协会旗下的核心期刊Virchows Archiv上。

资料来源：
Jiang, R., Zhang, B., Teng, X. et al. Validatinga targeted next-generation sequencing assay and profiling somatic variants inChinese non-small cell lung cancer patients. Sci Rep 10, 2070(2020). https://doi.org/10.1038/s41598-020-58819-5